凤仙白粉病的病原菌鉴定

时间:2014-01-23 21:36:54

【摘要】摘 要:凤仙白粉病菌使凤仙花科植物叶片出现白色病斑 对河南商丘地区的凤仙白粉病菌进行了致病性分析、形态学及分子生物学鉴定 该病原

摘 要:凤仙白粉病菌使凤仙花科植物叶片出现白色病斑. 对河南商丘地区的凤仙白粉病菌进行了致病性分析、形态学及分子生物学鉴定. 该病原菌分生孢子椭圆形或桶形, 大小为 22~ 28 m 16~ 21 m. 分生孢子梗直立,圆柱形, 简单不分枝, 包含 1 个足细胞, 1~ 3个远基细胞, 3~ 6 个排列成链的桶形分生孢子, 大小为 112~ 180 m 9~ 12 m. 对该病原菌 r DNA ITS 进行 P CR 扩增和序列测定, GenBank 登记号为 FJ625796, 并对该序列和 GenBank中凤仙白粉菌 Podosphaera balsaminae 的 ITS 序列做了近邻归群法分析. 结果证明, 河南商丘地区的凤仙白粉病菌为 Podosphaera balsaminae, 这将为研究中国凤仙白粉病菌系统进化及凤仙白粉病的防治奠定基础.

关键词:凤仙白粉病菌; 形态特性; ITS中图分类号:S432. 44 文献标志码:A凤仙(Impatiens balsamina L. ), 别名小桃红是一年生草本植物, 以全草入药, 具祛风、活血、消肿、止痛之功效. 本文报道了凤仙白粉菌在河南商丘地区的发生, 并对其进行了致病性分析、形态学及分子生物学鉴定, 为进一步的凤仙白粉病菌系统进化研究奠定基础.

1 材料与方法1. 1 材料供试材料: 河南商丘师范学院校园内种植凤仙感染叶片.

1. 2 病原菌显微形态观察病菌染色采用台盼兰染色法[ 1]. 将感染叶片沿着主叶脉剪切成 1. 5 cm 1. 5 cm 的小块, 浸没于固定液( 无水乙醇: 冰醋酸= 3 1) 中, 脱去颜色为止; 叶片组织转入塑料试管中, 0. 3% 的台盼兰溶液覆盖, 水浴锅( 70 ) 中加热 1~ 2 min 后于染液中过夜; 用 2. 5 g mL- 1的水合三氯乙醛冲洗 3 次; 制成装片于显微镜下观察.

1. 3 病原菌致病性鉴定采集病叶, 用毛刷轻刷叶片表面孢子, 无菌水配制成浓度为 5 104mL- 1的分生孢子悬浮液, 喷雾接种至健康的凤仙叶片进行致病性分析.

1. 4 病原菌分子生物学鉴定采用改良的 CTAB 法提取凤仙白粉菌 DNA[ 2]. 引物为真菌核糖体 IT S 区段的通用引物 IT S1F 和IT S4[ 3]. PCR 反应体系( 20 L) : 10 buffer 2 L, dNTP 混合物( 2. 5 mmol L- 1) 1. 6 L, Mg2+( 25 mmolL- 1) 1. 6 L, 引物( 10 pmoL L- 1) 各 1 L, Taq 聚合酶( 5 U L- 1) 0. 2 L, 模板 DNA 2 L, 无菌水10. 6 L. PCR 反应条件: 95 变性 5 min; 95 变性 30 s, 52 退火 45 s, 72 延伸 1 min, 共 30 个循环; 最后 72 延伸 10 min. PCR 产物纯化后克隆至 pMD18- T 载体上, 转化至 E. coli感受态细胞中, 质粒 PCR鉴定阳性菌落, 正反双向测序.

1 t ct t ggt cat t t agaggaag t aaaagt cgt aacaaggtt t ccgt aggt ga acct gcggaa61 ggat cat t aC T GAGCGCGAG GCCCCGCAGC GCGC AC GCGC TGCGGCGGT T GACCCTCC AC121 CCGT GTGAAC T CT TAT CT GT T GC TT TGGCG GGCCGGGCTC GACCTGCCGG CT CCGGCT GG181 CGAGTGCCCG T CAGAGAAGC CCCAACT CGT GCTGT GAGT G T TGTC TGAGG AAAT GT GGAA241 T T AGt aaaac t t t caacaac ggatct ct tg gct ct ggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa301 t gcgat aagt aat gt gaat t gcagaat t ta gt gaat catc gaat ct t tga acgcacatt g361 cgccccccgg cat t ccgagg ggcat gcct g t t cgagcgt c AGAACACCCC T CAAGCCTAG421 CT T GGT CT T G GGGCT CGCCG GCT CGGCGGC CCCT AAACGC AGT GGCGGT G CT GGT GT GCT481 CT CCGCGT AG T CAT GT AT CT CGCGACAGAG T GGCGACGGC ACCCGCCAGA ACCCCAGT CT541 T T GGat g acc t cg gat cag g t agg g atacc cg ct gaact t aagcatat ca at aagcg g ag601 g aa1~ 69 bp( 小写字母) 序列为部分 18 S rDNA 序列; 70~ 244 bp( 大写字母) 为 IT S1 区段序列; 245~ 400 bp( 下划线部分)为 5. 8 S rDNA 的全序列; 401~ 544 bp(大写斜体)为ITS2 区段序列; 545~ 603 bp(小写斜体)为部分28 S rDNA 序列.

图 3 凤仙白粉菌ITS 核酸序列(FJ625796)结构图2. 4 ITS 同源序列比对和系统进化树构建凤仙白粉菌FJ625796 序列在 GenBank 核酸序列数据库中进行 BLASTn 搜索, 发现其与 GenBank 中登记的凤仙白粉菌 P odosphaera balsaminae 的 ITS 序列(登记号: AB462799, AB462800 和 AB462803) 具有100% 的同源性.

H irat a 等[ 5]于 2000 年将来自 60 个不同寄主植物的单丝壳属白粉菌(P odosphaera) 分为 27 个单元型( haplot ype) , 每一个单元型代表一个具有相同 IT S 序列的隔离群. 来自凤仙花科寄主的白粉菌隔离群被分类为单元型 24(登记号:AB040318)和单元型 15( 登记号:AB040344). 通过比对, 我们发现 FJ625796 的 ITS序列与单元型 27 完全一样, 这一类型处于隔离群系统进化树的最末端, 来自包含 7 个科(Asteraceae, Gesne-r iaceae, Lamiaceae, Verbenaceae, F abaceae, Cucur bit aceae 和 Malvaceae) 14 个种的不同寄主. 对 GenBank 核酸序列数据库中凤仙白粉菌 P odosphaera balsaminae 的 ITS 序列做近邻归群法分析, 分支上为 Bootstrap重复 1 000 次> 60% 的支持强度, 这些序列被分为 3支, 代表了 3 个不同的单元型( 27、25、14)的凤仙白粉菌( 图 2) . 有意思的是, 不同的单元型其凤仙寄主种( I mp at iens bal sami na , I mpa ti ens t ext ori 和 I mpa ti ens no-ti - ta ngere) 不同, 而同一单元型则具有相同的凤仙寄主种. 这说明了通过分子系统发育的聚类分析与通过病菌侵染性不同的分类具有普遍的一致性, 进一步证明了 寄主的特异性所导致的小生境的分离激发了白粉病菌的遗传趋异性这一观点[ 5]凤仙白粉菌 在美国、欧洲及亚洲均有报道[ , 5, 6], 我们从形态学、病原学及分子生物学方第 2 期 裴冬丽 : 凤仙白粉病的病原菌鉴定117:.

P. balsaminae42 结果与讨论2. 1 病原菌形态特征白粉菌主要感染凤仙叶片, 发病初期在叶片两面产生圆形白色粉状斑(图 1A) , 严重时粉状斑融合成片,致整个叶片被满白色粉状物, 甚至于茎、花及果实上均可染病. 病原菌经台盼兰染色后, 在显微镜下观察其形态, 并测量分生孢子及孢子梗大小. 该病原菌分生孢子椭圆形或桶形, 有明显的纤维体, 大小为 22~ 28 m16~ 21 m. 分生孢子梗直立, 圆柱形, 简单不分枝, 包含一个足细胞, 1~ 3 个远基细胞, 3~ 6 个排列成链的桶形分生孢子, 大小为 112~ 180 m 9~ 12 m(图 1B). 没有观察到凤仙白粉菌的子囊壳, 在其菌丝体中发现了凤仙白粉病菌寄生孢 Ampelomycesquisqualis(图 1C).

2. 2 病原菌致病性鉴定采用 5 104孢子 mL- 1浓度的分生孢子悬浮液对健康凤仙植株进行再接种, 5 d 后, 叶片上开始发病. 取接种后产生的病斑进行显微观察, 证实与接种病菌相同. 从植物感染病症和孢子形态结构上初步认定该病原菌为 Podosphaera balsaminae[ 4].

2. 3 病原菌分子生物学鉴定以凤 仙白粉病 菌的 DNA 为模板, 用 引物IT S1F 和 IT S4 进行 PCR 扩增, 得到 600 bp 左右的目的片段(图 2)对此片段进行序列测定, 长度为603 bp, 经 BLAST 分析发现, 该病原菌 IT S 区段核酸编码序列中 1~ 69 bp 为部分 18 S rDNA, 70~ 244 bp 为 IT S1 区段序列, 245~ 400 bp 为 5. 8 SrDNA 的全序列, 401~ 544 bp 为 I T S2 区段序列, 545~ 603 bp 为部分 28 S rDNA 序列( 图 3) . 该序列在G B 中登记号为 F 6 5 6116 河南师范大学学报( 自然科学版) 2011 年en ank J 2 79 .面对河南商丘地区的凤仙白粉病菌进行了系统研究与鉴定,将为准确预测各类白粉菌的种类并及时监测其小种分化, 并在此基础上开展白粉病检测和防治提供理论依据.

参 考 文 献[ 1] H uang C C, Groot T, M eije-r Dekens F, et al. Th e resist ance t o powdery m ildew ( Oi di um ly cop er sici ) in L ycopersi con species is m ainl yassociat ed wit h hypersen sit ive res ponses[ J] . Eu rop ean J ournal of Pl ant Pat hology, 1998, 104: 399- 407.

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[ 6] 郑儒永, 余永年. 中国真菌志[ M ] . ( 第一卷, 白粉菌目) . 北京: 科学出版社, 1987: 311- 313.

Identification of the Pathogen Causing Rose Balsam Powdery MildewPEI Dong- li1, 2( 1. Key Lab orat ory of Pl ant- Micr ob e In t eract ions, Depart m ent of Life Sciences, Shangqiu Norm al Un iversit y, Shan gqiu 476000, Chin a;2. Coll ege of Agronomy H enan Agricul tu ral U nivers ity, Zhengzhou 450002, China)Abst ract: P odosp haer a ba lsa mi na e has been recorded in China, which causing powdery mildew on I mpa tiens balsamina( rose balsam) . T he powder y mildew is found in Shangqiu field in H enan, it is test ed basing on the et iological, mor phologicaland molecular characterist ics. Conidia are ellipsoid or dolifor m, 22 ~ 28 m 16~ 21 m, conidiophor es ar e obser ved un-branched, cylindrica l, 112~ 180 m 9~ 12 m, containing a foot cell , 1- 3 distal cells and three to six ba rre-l shaped conidiaformed in chain. The inter na l transcr ibed spacer ( ITS) sequence is determined by PCR product amplifying and sequencing, thisnucleot ide sequence is assigned GenBank accession No F J625796, and The N- J phylogenetic analysis of this ITS sequence withother IT S sequences of P odosphaer a balsaminae from GenBank is made. The r esults show that the pathogen of rose balsampowdery mildew in Shangqiu is P odosphaer a ba lsa mina e. T his result will lay a foundation for the phylogeny analysis and dis-ease prevention of rose balsam powder y mildew in China.

Key words: P odosp ha era ba lsa minae ; morphological cha racteristics; ITS118 河南师范大学学报( 自然科学版) 2011 年

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